基础研究·人工关节感染翻修术后近期细菌学研究 ​

2017-08-24   文章来源:《中国骨与关节外科》   作者:丛锐军 符培亮” 刘伟 李晓华 吴海山 吴宇黎 赵辉 王波 (第二军医大学长征医院骨科,上海 200003 ) 点击量:1415 我要说

导 语

关节置换术后感染,二期翻修,对控制感染,彻底清除细菌遗传物质,避免细菌变异具有重要意义!近20年来,随着对骨感染细菌生物膜认识的深入,控制骨感染的一些新技术、新理念应用于临床,人工关节感染翻修术的治疗水平不断提高。骨感染专家共识及治疗进展存在存在争议。骨感染局部细菌生物膜形成及耐药,是骨感染经久不愈、反复发作的重要因素之一。也是近年来骨感染机制研究方面的最新进展,应用高浓度敏感抗生素杀灭局部细菌、预防细菌定植、形成感染的又一思路,相比局部应用抗生素具有独道的优势。

摘 要

背 景

感染是人工关节置换术后的灾难性并发症,治疗方式尚存争议,疗效不确定。

目 的

探索人工关节感染翻修术后近期关节和髓腔内细菌的残留情况,为其提供理论依据。

方 法

制作64只关节置换细菌感染的兔模型,30只为实验组,30只为阴性对照组,4只为备用组。实验组使用中空假体+输液港系统,行二期翻修,术后第1~4周的关节内灌洗液沉渣两等分,一份进行细菌培养,结果作为培养组;另一份使用聚合酶链反应(PCR)方法扩增遗传物质,结果作为PCR组。采用Pearson卡方分析检验翻修术后各时间点培养组和PCR组的组间差异,两两比较卡方分析检验培养组和PCR组不同时间点的时序性差异。

结 果

实验组动物术后伤口愈合好,术后第1~4周培养组和PCR组阳性率分别为10%、3.33%、3.33%、3.33%和 83.33%、40.00%、30.00%、26.67%,细菌学鉴定与植入细菌一致。各时间点培养组阳性率与PCR组检出率有统计学差异(=0.27,P=0.605);培养组第1~4周的阳性率无统计学差异;PCR组术后第1周的检出率与第2~4周比较有统计学差异(尸=0.001.0.000,0.000),第2~4周的检出率比较无统计学差异。

结 论

关节翻修术后,细菌在关节腔内的分布非常复杂,一期清创手术应慎重选择;遗传物质的残存作为潜在的危险因素带来临床症状,遗传物质残存在感染复发和细菌变异中的作用值得深入研究。

关键词

人工关节;假体感染;翻修手术;细菌培养;细菌遗传物质

人工关节置换术后感染是灾难性并发症,可导致手术失败,患者可能需要移除假体甚至截肢,带来巨大的精神和经济负担。1个月内的急性感染采用保留假体、清创、使用抗生素治疗的手术成功率为26%-70%[1-2],而慢性感染需二期翻修[3-6],二期翻修是感染治疗的金标准[7-10],原则是彻底清除所有异物,全身使用抗生素,局部使用抗生素骨水泥间置器,感染临床治愈后植入翻修假体,术中行冰块切片。对于两次手术时间、两种手术方式及抗生素骨水泥间置器的类型均存在争议[11-14]。此外,临床上很多患者和文献中报道,即使感染临床治愈后,部分患者会出现伤口周围特发性红肿和不明原因的湿疹,无论是否使用抗生素,这些症状都能得到缓解[15]。本文探索人工关节感染翻修术后近期关节和髓腔内细菌的残留情况,为上述争议和症状提供理论依据。

一材料与方法

1.1实验材料

健康成年新西兰成年大白兔64只(其中四只为备用组),雌雄不限,体重2.5-3.5kg,平均2.8kg(第二军医大学药学院动物试验中心提供),清洁级,适应性喂养1周,自由进食、饮水。

1.2实验方法

1.2.1动物模型制作与实验设计

使用膝前外侧入路,暴露兔膝关节前髁,注意保护髌腱及前髁韧带,于负重面适当位置开槽,避免损伤交叉韧带后后外侧神经血管,用定制锉刀修整截骨面,植入定制型生物假体(图1)

检查假体牢固度,确定假体位置及牢固度较好后冲洗关闭伤口。术后第2天注入SESAL65164金葡菌(第二军医大学微生物教研室提供)1X106CFU,1周后进行关节腔穿刺细菌培养,1只动物死亡,1只穿刺培养未得到细菌,备用组2只替代,30只感染模型构建成功[16]。实验组30只翻修术后第1-4周分别行关节灌洗液沉渣细菌培养和关节灌洗液沉渣遗传物质聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)检测,细菌培养结果检测为培养组,PCR检测结果为PCR组将各时间点的培养组阳性率和PCR组检出率进行组间比较,同时将不同时点的培养组阳性率和PCR组检出率进行时序性比较。此外,设立30只为阴性对照组,旨在说明未进行关节翻修的关节腔内细菌可以持续检出,阴性对照组不用于统计分析。

1.2.2翻修手术

采用二期翻修手术,关节置换原切口入路,切开外侧肌群后暴露兔膝关节,避免损伤髌韧带、前髁韧带、侧副韧带和交叉韧带;彻底清除关节腔内异常组织,取出原假体,双氧水、洗必泰、生理盐水反复冲洗浸泡后,更换手套及手术器械,实验组使用中空多孔关节假体+植入式输液港系统(巴德公司提供)作为间置器填充,关节假体为定制的生物型假体,出现严重骨缺损的个体采用,大直径假体,不使用骨水泥填充(图2);阴性对照组未行手术干预。实验组动物二期翻修中,1例出现假体周围骨折,备用组代替[11.14]

1.2.3围手术期手术处理

每天观察实验组动物体温、进食和伤口情况,观察远端肢体运动情况。实验组术后1周内通过输液港行关节内腔头孢唑啉1g溶于500ml生理盐水灌洗25min,后用生理盐水2500ml冲洗,全身使用头孢唑啉0.1gTid(肌肉注射),1周后停用抗生素。阴性对照组仅全身使用抗生素0.1gTid(肌肉注射)。

1.2.4观察指标

术后第1-4周,通过输液港行关节腔内2500ml生理盐水灌洗,全部灌洗液离心(600xg,10min),取沉渣,两等分,分别用于细菌培养[17]取沉渣,两等分和PCR检测23SrRNA基因、nuc基因[18-19]。细菌培养条件为5%去纤维羊血培养基,37度恒温增菌培养箱培养48小时,阴性结果继续培养1周,阳性结果行过氧化氢实验和凝固酶实验,并抽提DNA鉴定菌株类型。

1.2.5DNA抽提和PCR方法

使用QIAampDNA套装(Qiagen,德国)提取DNA。PCR反应体系每30µl包含1µlnuc引物或23SrRNA引物10pmol(Invitrogen,美国),5µlDNA模版,14µlPCR液(DNA聚合酶Mgcl2,dNTPs)(Roche,德国)完成扩增(表1)。二期翻修术后第4周,随机处死实验组15只,分别取假体周围、髓腔中断、髓腔远端组织,冰冻切片后革兰染色找金葡菌(图3),并取部分组织块增菌培养,并行过氧化氢实验和凝固实验[17-20]

1.3统计学处理

数据对实验者和统计员双盲。应用SPSS13.0统计软件,并使用配对样本pearson卡方分析比较各时间点培养组阳性率和PCR组检出率的组间差异,P<0.05为有统计学差异;使用Pearson卡方分析两两比较不同时间点的培养组阳性率和PCR组检出率的时序性差异,P<0.05为有统计学差异。

二结 果

2.1组间大体观察

实验组术后体温均正常、伤口愈合好,术后第3周缝线开始陆续脱落,远端肢体运动好,进食量未见明显减少;对照组术后7只体温升高,进食量减少,伤口红肿、渗出、愈合差,术后3-4周,其中4只窦道行形成,每天换药可见淡黄色浓性渗出物5-20ml,细菌学检验为凝固酶阳性、过氧化氢酶阳性、革兰氏阳性球菌,DNA鉴定为SESAL65164金葡菌株,其中一只同时检出革兰氏阴性杆菌。

2.2实验组细菌培养结果和PCR检测结果

术后第1周灌洗液呈棕红色、混悬液,离心后得到灰红色沉淀3.6g,第2周灌洗液呈淡红色、混悬液离心后得到灰白色沉淀3.2g,第3周灌洗液为无色透明悬液离心后得到灰白色沉淀3.5g,第4周灌洗液为无色透明悬液,沉淀后得到黄白色沉淀3.0g。

细菌培养结果示

术后第1-4周培养组阳性率分别为10%、3.33%、3.33%、3.33%。第1周3只标本有细菌生长、余未见细菌生长,细菌学检验示凝固酶阳性葡萄球菌,DNA鉴定为SESAL65164金浦菌株;第2-4周,其中2只可见细菌生长,余未见细菌生长。术后第4周处死的实验组15只冰冻切片革兰氏染色,该只股骨后侧肌肉组织内发现革兰氏阳性球菌存在,同部位组织块血培养,见凝固酶阳性、过氧化氢霉阳性球菌生长,DNA鉴定为SESAL65164金葡菌株。

PCR检测特定23SrRNA基因和nuc基因的组内结果分布结果显示

术后第1-4周两组基因的组内分布无统计学差异,其检出率分别为83.33%、40.00%、30.00%、26.67%(表2、3)。

2.3各时间点的组间差异和各组的时序性差异

实验组二期翻修术后各时间点的培养组结果和PCR组结果均有统计学差异(表4),认为术后第1-4周灌洗液沉淀物的细菌培养阳性率和PCR检出率不一致,且细菌培养结果均低于PCR检查结果。各组的时序性比较表现,实验组二期翻修术后第1-4周的PCR组结果持续下降,第1周的PCR检出率与第2-4周比较有统计学差异(P=0.001,0.000,0.000),而第2-4周之间无显著性差异(图4)。术后细菌培养结果时序分析显示,术后第1-4周的细菌培养阳性率和PCR检出率与阴性对照组均无统计学差异,认为实验组干预有效,细菌培养阳性率与PCR检率率的差别并由假阳性误差偏倚引起。

三讨 论

目前关节周围感染的治疗方式包括清创保留假体抗生素治疗、一期清创+翻修术、二期翻修术。

早期的大样本关节置换感染认为

抗生素骨水泥假体二期翻修,平均随访4.8年,手术成功率超过80%,近期研究认为生物型假体一期翻修,随访3-4年,可以得到相似的结果,Soriano等[2]认为急性感染2周内,细菌菌膜未形成前行关节清创术、保留假体治疗后,感染再发率达30%;本实验在输液港帮助下,全身、局部使用抗生素,合并局部灌洗治疗1周后,灌洗液细菌培养阳性率为10%,金葡菌遗传物质检出率为83.33%,作者认为急性感染单纯清创治疗的有效率值得商榷。二期修复放置spacer填充虽增加了手术次数,但细菌清除率得到了保证,实验中的中空假体+输液港装置可实现术后实时灌注和关节液培养,同时减少置管的逆向感染等问题,减少患者的创伤。

传统关节无论是一期手术还是二期翻修的前提是彻底清除细菌,关节周围感染主要是革兰阳性球菌,其中以金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌为主。文献报道,即使在严格伤口护理及每天换药的情况下,不同培养时间得到的细菌亦可能不一致,本实验对照组中1只出现类似情况。该现象的原因出现未见到文献报道。

文献证实,随着生存环境的变化细菌会改变适应环境;关节腔内结构复杂,滑膜组织和肌肉间隙非常多,当处于休眠状态的细菌被包裹在这些软组织间隙时,是否会引起机体的炎性反应。是否具有趋化作用和免疫源性,目前尚未得到研究。清创后4周内,虽然细菌培养未见细菌生长,但细菌遗传物质不断被检出,且两者间具有统计学差异,抗生素的抑制作用、细菌生物活性改变、死亡细菌的遗传物质残留都会导致这种差异,有待进一步验证细菌活性、毒性和基因分型等。

关节液内无血液,无法形成有效抗生素环境,当内环境事宜时残留的细菌和死亡细菌的遗传物质会再次成为危险因素。新的细菌定植时,致病因子的基因通过转座作用整合在新细菌体内,如一些细菌形成菌膜的能力和一些细菌耐药性的获得是通过鞭毛交换遗传物质实现的,因此局部大量检查金葡菌遗传物质亦为危险因素[21-23]。即使是遗传物质本身再次入血也会导致超敏反应发生。

时序检测证实细菌的遗传物质检出率随时间延长而急剧下降,而细菌培养的阳性率也有所下降,作者推测与输液港的冲洗作用和组织的代谢密切相关,增加手术间隔对提高翻修手术的成功率非常有意义。本实验中1只持续细菌培养阳性可能与清创不彻底、间隙内细菌残 留并持续释放有关,临床指标持续不下降应考虑穿刺或灌洗培养,只要细菌培养阳性应尽快二次清创,并彻底寻找隐藏细菌。

综上所述

关节翻修术后细菌在关节腔内的分布非常复杂,一期清创手术的选择应非常慎重;遗传物质的残存作为潜在危险因素可带来临床症状,遗传物质残存在感染复发和细菌变异中的作用值得深入研究。

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