膝关节骨关节炎（knee osteoarthritis，KOA）是一种以软骨损伤为主要病理改变，同时伴有软骨下硬化、滑膜炎、骨赘形成及软组织松弛的常见膝关节疾病^［1-2］。一项大规模的流行病学调查指出，KOA在男性人群中的患病率为38.7%，女性为44.2%^［3］。透明质酸（hyaluronic acid，HA）作为关节滑液的重要成分之一，是关节滑液具有黏弹特性的基础^［4］。HA在人体膝关节中发挥着震荡缓冲、润滑剂及软骨保护膜的重要作用^［5］。一系列研究表明，KOA的病情进展与HA的合成质量有关，即高水平的炎症因子可抑制滑膜细胞的HA合成功能，引起HA的分子量减少与高级结构缺失^［6-7］，促使关节液的黏弹性下降，进一步加重膝关节所承受的应力，最终导致软骨损伤，病情进展^［8］。

理论上，关节腔注射外源性HA可望补充内源性HA不足，以发挥治疗效应^［9］。大量临床研究发现HA可缓解KOA症状并改善膝关节功能^［10-12］；但也有部分临床研究认为膝关节腔内注射HA缺乏临床疗效^［13-15］。因此，目前关于透明质酸治疗KOA的临床疗效评价存在矛盾。

文献报道，HA治疗效应的发挥应满足药物可充分覆盖软骨损伤区域的表面^［16］。然而，目前有关HA在膝关节软骨特定区域的覆盖特征及相关影响因素尚不明确，同时鲜见HA给药位点差异对KOA疗效影响的临床及基础研究。Jackson等^［17］比较了膝关节前内侧、膝关节前外侧、髌骨旁三种给药途径的首次针头置入关节腔成功率（前外侧为71%，前内侧为75%，髌骨旁为93%），以探究如何避免HA注入髌下脂肪垫或滑膜组织造成的疗效下降或患者不适感。但该研究并未关注药物在关节腔内的分布特征。

是否存在可能，即不同给药位点造成HA在膝关节腔内分布范围的差异，从而导致HA无法实现病灶覆盖，影响了HA对KOA的疗效，最终引起临床研究结论差异？鉴于此，本研究拟采用大体膝关节标本作为试验对象^［18］，将亚甲蓝与HA均匀混合实现染色示踪，并于Electro Force 力学测试平台进行步行模拟试验，目的在于：①直接观察不同给药位点注射HA（剂量2.5 ml）在膝关节软骨表面的覆盖范围，②探究影响HA在膝关节腔内分布的相关因素，③探索最有利于药物在病灶局部覆盖的给药位点。

材料与方法

一、样本分组

2014年9月至2014年12月，收集关节囊完整的膝关节大体标本32例，所有标本均自南方医科大学解剖教研室，并获伦理委员会审核批准。采用后前位X线测量所有膝关节标本的股骨髁宽，然后在调整放大率后按股骨髁宽从小到大排列，并从1~32赋予编号，其中奇数编号为髌骨下给药组（髌骨内侧给药途径），偶数编号为关节线给药组（胫股内侧关节线给药途径），每组各16例。所有膝关节截取髌骨上方和胫骨结节下方10 cm范围，并以牙托粉包埋，备模拟步行试验使用。

二、HA-亚甲蓝混合制剂的制备与稳定性评价每支HA注射液（佰备，上海景峰制药股份有限公司，2.5 ml∶25 mg）2.5 ml加入质量浓度为5%的亚甲蓝75 μl，均匀混合；混合后分别静置0、3、6、12 h，观察混合制剂是否存在组分分离现象，以判断亚甲蓝是否能客观显示HA的到达位置。

三、HA给药方法

髌骨下给药：膝关节取自然伸直状态，以髌骨内侧中点为穿刺点，注射器与水平面成15°~20°进入关节腔，针头到达髌骨中心下方（图1A），缓慢匀速注射HA-亚甲蓝制剂2.5 ml。关节线给药：膝关节取90°屈曲状态，以髌骨内侧缘与下极连线交点为穿刺点，注射器垂直进入关节腔，针头到达股骨内侧髁内侧缘（图1B），缓慢匀速注射HA-亚甲蓝制剂2.5 ml。

图1 髌骨下给药途径与关节线给药途径示意图A 髌骨下给药途径：膝关节取自然伸直状态，穿刺点为髌骨内侧中点，注射器与水平面成15°~20°进入关节腔，针头到达髌骨中心下方B 关节线给药途径：膝关节取90°屈曲状态，穿刺点为髌骨内侧缘与下极连线交点，注射器垂直进入关节腔，针头到达股骨内侧髁内侧缘

四、步行模拟试验

HA-亚甲蓝制剂注射完成后，将膝关节大体标本立即固定于Electro Force生物力学装置（Bose Cor⁃poration Electro Force Systems Group，图2），驱动膝关节大体标本进行5°~45°的反复屈伸，按照45 循环/min的速率模拟膝关节行走运动2h。

图2 膝关节标本在Electro Force生物力学平台上行步行试验示意图

五、膝关节表面分区

对Peterfy等^［19］膝关节表面分区法进行改良，形成膝关节表面8分区：①髌骨区；②股骨滑车区，股骨髁间穹窿与股骨内、外髁最高缘围成的梯形区域；③股骨内侧髁前区，内侧半月板后角关节囊附着部位以前、内侧髁最高缘以外围成的区域；④股骨外侧髁前区，外侧半月板后角关节囊附着部位以前、外侧髁最高缘以外围成的区域；⑤股骨内侧髁后区，内侧半月板后角关节囊附着部位以后区域；⑥股骨外侧髁后区，外侧半月板后角关节囊附着部位以后区域；⑦胫骨平台内侧区，无软骨覆盖区以内区域；⑧胫骨平台外侧区，无软骨覆盖区以外区域（图3）。

图3 膝关节表面8分区法示意图A 髌骨区B 股骨内侧髁前区，内侧半月板后角关节囊附着部位以前、内侧髁最高缘以外围成的区域C 股骨滑车区，股骨髁间穹窿与股骨内、外髁最高缘围成的梯形区域D 股骨外侧髁前区，外侧半月板后角关节囊附着部位以前、外侧髁最高缘以外围成的区域E 股骨内侧髁后区，内侧半月板后角关节囊附着部位以后区域F 股骨外侧髁后区，外侧半月板后角关节囊附着部位以后区域G 胫骨平台内侧区，无软骨覆盖区以内区域，S为无软骨覆盖区（下同） H 胫骨平台外侧区，无软骨覆盖区以外区域

六、药物覆盖范围赋分

目前，药物覆盖范围评定尚缺乏相关参考方法，本研究组根据多次预试验结果，提出按特定分区范围内被HA-亚甲蓝制剂所染色的面积占该区域总面积的比例进行等级评定：①染色面积＜区域总面积1/5，为0分；②染色面积占区域总面积1/5~2/5，为1分；③染色面积占区域总面积2/5~3/5，为2分；④染色面积占区域总面积3/5~4/5，为3分；⑤染色面积>区域总面积的4/5，为4分（表1）。

表1

七、HA药物分布区域分析

对于每个软骨表面分区，以股骨髁宽为横坐标、药物覆盖评分为纵坐标，绘制散点图；观察不同给药位点HA在膝关节表面不同区域的药物覆盖范围，了解不同给药位点所对应的药物分布范围及与股骨髁宽的相关性趋势。

八、统计学分析

采用SPSS 19.0 统计软件（SPSS 公司，美国）进行统计学分析。药物覆盖范围评分为等级资料，两组间比较采用Mann⁃Whitney检验；HA在亚组间膝关节表面区域的药物覆盖评分与股骨髁宽的相关性采用秩相关检验法（仅对两组药物覆盖评分出现统计学差异的膝关节表面分区与股骨髁宽作相关性检验）。检验水准α值取双侧0.05，相关系数（r）绝对值>0.7为具有较好相关性。

结　果

一、HA-亚甲蓝混合制剂稳定性试验

HA-亚甲蓝混合制剂于室温下分别静置3、6、12 h，均未见组分分离现象，提示混合制剂能客观反映HA到达位置（图4）。

图4 HA-亚甲蓝混合制剂稳定性试验，放置0 h（A）、3 h（B）、6 h（C）、12 h（D）未见分层现象，
提示混合制剂具备良好稳定性，满足示踪需要

二、不同股骨髁宽膝关节的HA药物覆盖范围

分别采用髌骨下和关节线给药后，膝关节表面的药物覆盖范围评分散点图见图5。观察各个分区的散点图可见，当股骨髁宽≤ 7.0 cm时，除胫骨平台外侧区外，两组对应的HA药物分布区域散点连线呈黏合现象；当股骨髁宽>7.0 cm时，髌骨区、股骨滑车区、股骨外髁前区、股骨内髁后区、股骨外髁后区、胫骨平台外侧区的药物分布区域散点连线出现明显分离现象。这提示HA在膝关节表面的分布范围可能受膝关节股骨髁宽的影响。

根据测量结果进一步将每组样本分为股骨髁宽≤ 7.0 cm 的小体型膝关节亚组以及股骨髁宽>7.0 cm的大体型膝关节亚组。最终，小体型-髌骨下给药亚组9例，小体型-关节线给药组8例，大体型-髌骨下给药组7例，大体型-关节线给药组8例；分别分析每组药物覆盖、给药方式与股骨髁宽三者间的关系。

图5 髌骨下给药组及关节线给药组在各软骨表面分区的股骨髁宽-药物覆盖评分散点图：当股骨髁宽≤ 7.5 cm时，除胫骨平台外侧区外，两组对应的HA药物分布区域散点连线呈黏合现象；当股骨髁宽>7.5 cm时，髌骨区、股骨滑车区、股骨外髁前区、股骨内髁后区、股骨外髁后区、胫骨平台外侧区的药物分布区域散点连线呈逐渐分离现象

三、小体型膝关节HA药物覆盖范围

对小体型膝关节亚组，在胫骨平台外侧区的药物覆盖评分秩次关节线给药组（11.50）高于髌骨下给药组（6.78），两组差异有统计学意义（Z=-2.397，P=0.017）；其余各分区药物覆盖评分秩次比较，差异无统计学意义（图6，表2）。

表2

图6 小体型膝关节髌骨下给药和关节线给药途径所对应药物覆盖范围的评分秩次对比柱状图，在胫骨平台外侧区的药物覆盖评分关节线给药组高于髌骨下给药组，两组差异有统计学意义；其余各区域药物覆盖评分比较差异无统计学意义

图7 大体型膝关节髌骨下给药和关节线给药途径所对应药物覆盖范围的评分秩次对比柱状图，在髌骨区、股骨滑车区的覆盖评分髌骨下给药组显著高于关节线给药组；在股骨外髁前区、股骨内髁后区、股骨外髁后区、胫骨平台外侧区的药物覆盖评分则显著低于关节线给药组

四、大体型膝关节HA药物覆盖范围

对于大体型膝关节亚组，髌骨下给药组与关节线给药组在髌骨区、股骨滑车区、股骨外髁前区、股骨内髁后区、股骨外髁后区、胫骨平台外侧区的染色评分秩次比较，差异有统计学意义，其中在髌骨区（12.00 vs 4.50）、股骨滑车区（11.79 vs 4.69）HA药物覆盖评分秩次髌骨下给药组显著高于关节线给药组（均P=0.001，表2），在股骨外髁前区（4.79 vs10.81）、股骨内髁后区（4.71 vs 10.88）、股骨外髁后区（4.00 vs 11.50）、胫骨平台外侧区（4.00 vs 11.50）HA 药物覆盖评分秩次则显著低于关节线给药组（均P＜0.05，表2，图7）。

五、小体型和大体型膝关节在关节表面各区域分布差异的大体观察

对于不同大小的膝关节，不同给药位点的HA在膝关节软骨表面呈现截然不同的药物分布特
征。以股骨髁宽衡量膝关节大小，当股骨髁宽≤7.0 cm时，不同给药途径对应的HA药物分布范围大致类似（唯一差异区域位于胫骨平台外侧区）；但当股骨髁宽>7.0 cm时，多个区域出现药物分布差异，采用髌骨下给药时，HA药物分布主要分布于髌股关节及前关节腔，而采用关节线给药则主要分布于胫骨关节及后关节腔（表3）。

注：小体型组，髌骨下给药和关节线给药时药物分布无明显差异，基本能完整覆盖整个膝关节；大体型亚组，髌骨下给药时药物主要分布在髌股关节，关节线给药时药物主要分布在胫骨关节

六、HA药物覆盖范围与股骨髁宽的相关性

相关性分析结果显示：体型越大不同给药位点的HA分布差异越明显，体型越小差异越不显著。

对于小体型膝关节，髌骨下给药和关节线给药的药物覆盖评分仅在胫骨平台外侧区有统计学差异（P=0.017，表2），故仅对该区作相关性分析。结果显示：髌骨下给药组的股骨髁宽与药物覆盖评分呈负相关关系（r=-0.940，P＜0.001），关节线给药组的股骨髁宽与药物覆盖评分无相关性。

对于大体型膝关节，髌骨下给药和关节线给药的药物覆盖评分在髌骨区（P=0.001）、股骨滑车区（P=0.001）、股骨外髁前区（P=0.005）、股骨内髁后区（P=0.006）、在股骨外髁后区（P=0.001）、胫骨平台外侧区（P＜0.001）有统计学差异，故对这些分区作相关性分析。结果显示：在髌骨区，髌骨下给药组的股骨髁宽与药物覆盖评分无相关性，关节线给药组
则呈负相关关系（r=-0.743，P=0.035）；在股骨滑车区、股骨外髁前区、股骨内髁后区，髌骨下给药组和关节线给药组的股骨髁宽与药物覆盖评分均无相关性；在股骨外髁后区（r=-0.791，P=0.034）、胫骨平台外侧区（r=-0.926，P=0.003），髌骨下给药组的股骨髁宽与药物覆盖评分呈负相关关系，关节线给药组则无相关性（表4）。

表4

讨　论

一、HA膝关节腔注射的传统观点

传统观点认为HA经皮穿刺进入膝关节腔后，膝关节各间室相互交通，从不同位点进入关节腔内的HA经过膝关节活动，药物将向四周均匀扩散，可在膝关节各间室和软骨表面各区域均匀分布^［18］。在这一传统“默认”观点的基础上，研究者普遍不考虑给药位点对临床研究结果带来的偏歧，臆断随着膝关节的运动可实现HA均匀分布，给药位点差异对KOA疗效不会产生影响^［20-22］。

二、药物分布与到达的重要性

基于HA发挥疗效的作用机制，HA必须实现对病变软骨区域的覆盖，才能最大限度发挥表面润滑、软骨保护，甚至软骨修复效应^［16］。但如果从某一既定的位点给药，药物并不能到达特定的软骨病变区域，则必定严重削减药物疗效的发挥。值得关注的是，至今这一问题恰恰被“所有”临床研究所忽略。KOA实际上是髌股关节骨关节炎、内侧胫股关节骨关节炎及外侧胫股关节骨关节炎的总称^［23］。如果药物仅分布于胫股关节面，若KOA主要症状源于髌股关节时，在HA药物无法到达前提下，HA治疗KOA的疗效必定大打折扣，甚至缺如。因此，可以推断，对给药位点影响药物分布范围这一问题的忽略，将造成HA给药位点混乱，进而导致无法保障药物到达病灶软骨区域。这很可能是引起本文前言中提及的数个临床试验对HA治疗KOA疗效评价出现差异的关键原因。

三、药物分布、给药位点、膝关节体型的关系

本研究聚焦于不同给药位点对HA在关节软骨表面分布范围的影响。试验结果发现，HA通过不同的给药位点进入关节腔后，其药物分布根据给药位点和膝关节大小的差异存在明显不同。当膝关节股骨髁宽≤ 7.0 cm时，髌骨下给药与关节线给药途径下HA的分布在膝关节腔内绝大部分区域无统计学差异（胫骨平台外侧区除外）；当膝关节股骨髁宽>7.0 cm时，髌骨下给药与关节线给药途径下HA的分布在髌骨区、股骨滑车区、股骨外髁前区、股骨内髁后区、股骨外髁后区、胫骨平台外侧区有统计学差异。

可见，对于临床最常使用的2.5 ml剂量HA，不论通过哪种位点给药，HA制剂均不能实现对全部关节软骨表面的完整覆盖。给药位点差异对药物分布特征的影响，以股骨髁宽7.0 cm为界出现显著差异，而且这种差异随着膝关节体型的增大而趋于更加明显。以股骨髁宽为判断膝关节体型大小的简易标准，当膝关节股骨髁宽≤ 7.0 cm时，髌骨下给药与关节线给药的HA分布基本相似；当股骨髁宽>7.0 cm时，髌骨下给药与关节线给药的HA分布差异随膝关节体型增大而递增。从髌骨下给药的HA更倾向分布于髌股关节和前关节腔，而从关节线给药的HA更倾向分布于胫股关节和后关节腔。

因此，为了保证HA经皮穿刺注射入膝关节腔后能到达病灶软骨区域，在不改变HA剂量的前提下，应该根据膝关节体型大小和软骨病损所在位置选择最合适的给药位点。当患者膝关节体型较小（股骨髁宽≤ 7.0 cm）时，无论对于髌股关节骨关节炎还是胫股关节骨关节炎，可根据操作者的个人习惯随机选择成功率较高的给药途径；但当患者膝关节体型较大（股骨髁宽>7.0 cm）时，对于髌股关节受损为主的骨关节炎，应该优先选择髌骨下给药途径，而对于胫股关节受损为主的骨关节炎，则应该优先选择关节线给药途径。

四、本研究的局限性

首先，本研究属大体标本水平，研究结论向临床应用的转化仍需前瞻性临床随机对照试验进行验证；其次，步行模拟试验的时长为2 h，理论上2 h后的药物分布已趋向稳定，但相对于真实人体膝关节活动对药物的持续影响仍有一定模拟缺陷，克服这一缺陷需采用其他示踪方式观察药物在人体膝关节内的分布特征；最后，本研究仅对膝关节标本进行屈伸5°~45°的模拟，今后将进一步探究膝关节更大活动范围对药物分布的潜在影响。

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