尤武林      王坤正    段大鹏      王春生     樊立宏   刘瑞宇

摘  要: 目的构建插头/翼状螺旋转录因子C2（homo sapiens forkhead box C2，Foxc2）基因慢病毒载体并转染兔BMSCs，检测其在BMSCs中的表达，为进一步应用携带Foxc2基因的BMSCs移植治疗股骨头缺血性坏死奠定实验基础。 方法通过RT-PCR法获得人Foxc2基因片段，将该片段克隆至包含绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的慢病毒载体LV-GFP中，重组获得Foxc2慢病毒质粒，将其与pGC-LV载体、pHelper1.0载体、pHelper2.0载体共转染293T细胞，获得Foxc2基因慢病毒载体；检测病毒滴度。分离、培养兔BMSCs，以Foxc2基因慢病毒载体转染第3 代BMSCs，通过荧光表达法判定最佳感染复数（multiplicity of infection，MOI），并以最佳MOI进行转染，倒置荧光显微镜观察、Western blot法检测转染1、3、7 d BMSCs中Foxc2的表达；对转染后BMSCs行成骨诱导，茜素红染色法观察矿化物结节形成情况。 结果成功构建Foxc2基因慢病毒载体，经酶切及测序鉴定完全正确，能转染293T细胞并表达GFP，病毒滴度为2 × 108 TU/mL。Foxc2基因慢病毒转染BMSCs的最佳MOI为200，转染BMSCs 3 d后经免疫荧光检测84.5% ± 4.8%的BMSCs可表达Foxc2。Western blot 结果显示Foxc2在BMSCs中高表达，且在7 d内表达水平逐渐升高。成骨诱导培养2周后，茜素红染色示细胞质中有大量红色的钙化基质沉积。 结论成功构建并包装获得较高滴度的Foxc2基因慢病毒载体，慢病毒可高效并稳定转染BMSCs，Foxc2表达增加，为基因治疗股骨头缺血性坏死奠定了基础。