目的 建立SD大鼠表皮干细胞在体标记及免疫组织化学检测方法体系,为揭示表皮干细胞参与创面愈合的分子机制打下基础。
    方法 实验动物:10日龄雌性SD大鼠。BrdU 在体标记方法:BrdU (5-bromo-2'-deoxyuri-dine)作为核苷酸类似物,在细胞周期的S期可以插入DNA 分子,从而标记增殖的细胞,由于表皮干细胞的慢周期性,BrdU 标记能在其核中滞留。腹腔注射,单次注射剂量50ug/g体重,注射间隔12h,共注射6次,总注射剂量300ug/g体重。取样时间:末次注射后1h和30d。常规4%多聚甲醛固定皮肤,石蜡包埋。切片常规脱蜡,复水。免疫组织化学方法:用含Triton X-100等表面活性剂的抗原修复液37℃处理10min,PBS漂洗后,于0.1M 柠檬酸盐缓冲液中高压修复,按喷气时间计2.5min,缓冲液自然降至室温,3%H2O2/90%甲醇室温处理10min以灭活内源性过氧化物酶,2MHCL于37℃处理30min以变性DNA,后以0.1M 硼砂中和,一抗为小鼠腹水抗BrdU 单抗,二抗为HRP耦联的二抗,DAB显色,苏木素轻度复染。
    结果 BrdU 在体标记结束后1h的SD大鼠皮肤基底层中几乎所有细胞核及真皮中所有毛囊细胞核中可见强烈的棕色阳性信号;BrdU 标记30d后,SD 大鼠皮肤基底层中仍可检测到不少于20%的标记细胞。
    结论 建立了稳定可靠的SD大鼠表皮干细胞在体标记及免疫组织化学检测方法体系,为后续研究药物干预创面生物电场后表皮干细胞迁移变化规律打下了基础。