张彦男    邵增务   吴永超    王佰川    马凯歌   丁 凡   杨述华

  【摘要】 目的：分离兔髓核脊索细胞（notochordal cells，NC）及骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC），通过非接触共培养探讨NC对MSC细胞表型的影响。方法：4～6周龄新西兰兔8只，取胸腰段脊柱的髓核，用密度梯度离心提取NC，同时取其股骨骨髓用FICOLL液分离MSC，将NC和MSC等比例（1∶1）通过transwell培养板进行非接触共培养作为实验组，单纯MSC细胞培养作为对照组，光镜下观察细胞的生长情况。对两组的MSC行免疫组化及RT-PCR、Western-blot检测MSC细胞表型的改变情况。结果：原代NC呈圆形或椭圆形，细胞体积大，细胞增殖不明显；MSC贴壁生长，呈三角形或梭形，漩涡状排列。甲苯胺蓝染色：对照组MSC细胞核淡染，胞体染色不明显，染色阴性；实验组MSC可见从第3天开始胞体及胞外基质出现紫红色，第5天染色更加明显。Ⅱ型胶原免疫组化对照组MSC淡染，细胞形态不清楚；实验组第3天出现MSC内出现棕黄色深染，随着时间推移细胞染色加深呈阳性表现。RT-PCR检测，经过5d非接触共培养后实验组蛋白聚糖的基因表达为对照组的2.35倍（P＜0.05），Ⅱ型胶原的基因表达为对照组的1.61倍（P＜0.05），对照组Ⅰ型胶原的基因表达为实验组的2.56倍（P＜0.05）。Western-blot检测后发现：经过5d非接触共培养，实验组蛋白聚糖的含量为对照组的1.61倍（P＜0.05），Ⅱ型胶原的表达为对照组的10.04倍（P＜0.05）（P＜0.05）。结论：在非接触共培养条件下脊索细胞可以诱导骨髓间充质干细胞表型发生变化，向类软骨细胞方向分化，这将为组织工程化髓核的种子细胞筛选提供新选择。